(1).jpg)
Доработанный текст проекта Приказа Министерства сельского хозяйства РФ "Об утверждении Методики производства молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства лекарственных средств для ветеринарного применения" (подготовлен Минсельхозом России 31.07.2018)
Досье на проект
В соответствии с пунктом 13 Правил государственной регистрации генно-инженерно-модифицированных организмов, предназначенных для выпуска в окружающую среду, а также продукции, полученной с применением таких организмов или содержащей такие организмы, утвержденных постановлением Правительства Российской Федерации от 23.09.2013 N 839 (Собрание законодательства Российской Федерации, 2013, N 39, ст. 4991; 2014, N 25, ст. 3317; 2017, N 28, ст. 4145; 2018, N 6, ст. 896), приказываю:
Утвердить прилагаемую Методику производства молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства лекарственных средств для ветеринарного применения.
| Министр | Д.Н. Патрушев |
Приложение
Утверждена
приказом Минсельхоза России
от ____________ N _____
Методика производства молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства лекарственных средств для ветеринарного применения
1. Настоящая методика устанавливает порядок проведения молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства лекарственных средств для ветеринарного применения (далее - исследование, ГМО).
2. Исследование проводится организациями (испытательными лабораториями), аккредитованными в национальной системе аккредитации, в отношении ГМО предназначенного для выпуска в окружающую среду в целях проверки данных о молекулярно-генетической структуре и генетической модификации ГМО, оценки эффективности метода идентификации ГМО.
3. В рамках исследования осуществляется анализ представленных юридическим лицом, осуществляющим на территории Российской Федерации генно-инженерную деятельность в целях создания ГМО (далее - заявитель), документов и данных:
а) наименования ГМО с указанием его таксономического статуса;
б) полного наименования, места нахождения, индивидуального номера налогоплательщика (ИНН) заявителя;
в) полного наименования и место нахождения юридического лица либо фамилия, имя, отчество (при наличии), место жительства индивидуального предпринимателя - изготовителя образцов ГМО;
г) вида предполагаемого целевого использования ГМО;
д) сведений об исходном организме (таксономическая характеристика с указанием метода идентификации);
е) сведений о трансформационном событии в виде кода, сформированного согласно Общероссийскому классификатору трансформационных событий;
ж) паспорт штамма, выданный уполномоченной коллекцией, в отношении случаев использования для производства лекарственных средств для ветеринарного применения ГМО растительного происхождения;
з) описания структуры внесенной или удаленной генетической конструкции и места ее локализации, характеристик встроенных или измененных генов;
и) информации о генетической модификации: описание метода модификации, структуры вектора, структуры вставки, расположении рекомбинантной ДНК (хромосома, плазмида, мобильные элементы), включая фланкирующие последовательности, включение в состав мобильных генетических элементов;
к) информации об организмах-донорах вносимых генов (с указанием группы патогенности при наличии);
л) описания методики, позволяющей идентифицировать ГМО, в том числе описания нуклеотидных последовательностей используемых праймеров, зондов и условий полимеразной цепной реакции (ПЦР);
м) регистрационного номера свидетельства о государственной регистрации ГМО, предназначенного (предназначенных) для выпуска в окружающую среду, на основе которого (которых) создан ГМО, в отношении которого проведено исследование (в случае если ГМО создан на основе иного (иных) ГМО);
н) регистрационный номер свидетельства о государственной регистрации ГМО для иного целевого использования (при наличии);
о) информации о регистрации ГМО за рубежом (при наличии);
п) данных полногеномного секвенирования ГМО (при наличии).
4. В рамках исследования осуществляются следующие испытания представленных заявителем образцов ГМО и исходного организма-реципиента:
а) проверка (валидация) методики идентификации ГМО, в том числе оценка чувствительности и специфичности данной методики в соответствии с критериями эффективности методики идентификации ГМО, указанными в таблице N 1 приложения к настоящей методике;
б) подтверждение присутствия (отсутствия) заявленной генетической модификации в геноме ГМО;
в) проверка (валидация) присутствия (отсутствия) незаявленных генетических модификаций в геноме генно-инженерно модифицированного организма.
5. Требования к проведению исследования приведены в приложении к настоящей методике.
В случае представления заявителем данных полногеномного секвенирования ГМО осуществляется подтверждение присутствия (отсутствия) в геноме ГМО часто используемых маркерных и селективных генов, являющихся частями генно-инженерных конструкций, указанных в таблице N 2 приложения к настоящей методике.
В случае отсутствия данных полногеномного секвенирования ГМО, такое секвенирование ГМО должно быть проведено организацией (испытательной лабораторией), осуществляющей проведение исследования.
6. Срок проведения исследования не может превышать 90 рабочих дней с момента представления заявителем документов и данных, предусмотренных пунктом 3 настоящей методики, а также образцов ГМО и исходного организма-реципиента, в количестве, необходимом для проведения исследования.
7. Результаты исследования оформляются заключением о результатах исследования, составляемым на основании протоколов испытаний, которое должно содержать:
наименование заключения;
полное наименование и местонахождение организации (испытательной лаборатории), осуществившей проведение исследования;
наименование ГМО с указанием его таксономического статуса;
место и номер депонирования штамма ГМО;
полное наименование, место нахождения, идентификационный номер налогоплательщика (ИНН) заявителя;
полное наименование и место нахождения юридического лица либо фамилия, имя, отчество (при наличии), место жительства индивидуального предпринимателя - изготовителя образцов ГМО;
вид предполагаемого целевого использования ГМО;
место и номер депонирования (указывается для депонированных штаммов ГМО);
сведения о трансформационном событии в виде кода, сформированного согласно Общероссийскому классификатору трансформационных событий;
регистрационный номер свидетельства о государственной регистрации ГМО, предназначенного (предназначенных) для выпуска в окружающую среду, на основе которого (которых) создан ГМО, в отношении которого проведено исследование (в случае если ГМО создан на основе иного (иных) ГМО);
регистрационный номер свидетельства о государственной регистрации ГМО для иного целевого использования (при наличии);
сведения о регистрации ГМО за рубежом (при наличии);
оценку полноты представленных заявителем документов и данных;
краткое содержание представленных заявителем документов и данных;
описание представленных заявителем образцов ГМО и исходного организма-реципиента с указанием их количества, а также оценку их пригодности для проведения исследования;
выводы о результатах исследования: о молекулярно-генетической структуре ГМО, об отсутствии или наличии не заявленных генетических конструкций; об эффективности метода идентификации ГМО, сведения о соответствии генетической модификации природным (естественным) процессам;
фамилии, имена, отчества (при наличии), должности, места работы, ученые степени (при наличии) лиц, проводивших исследование;
дату и номер заключения;
подпись руководителя организации (испытательной лаборатории), осуществившей проведение исследования.
8. К заключению о результатах исследования должны прилагаться протоколы испытаний, на основании которых оно составлено, подписанные лицами, проводившими испытания.
Если заявителем не представлены документы и данные, предусмотренные подпунктами "а"-"м" пункта 3 настоящей методики, и (или) образцы ГМО и исходного организма-реципиента, пригодные для проведения исследований, в количестве, необходимом для проведения исследований, исследования не должны проводиться. Заявителю должен быть выдан мотивированный отказ в проведении исследования, подписанный руководителем организации (испытательной лабораторией), аккредитованной в национальной системе аккредитации, в которую обратился заявитель для проведения исследования, в срок, не превышающий 20 рабочих дней с момента обращения заявителя в указанную организацию.
Приложение
к методике производства молекулярно-генетического исследования
генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства
лекарственных средств для ветеринарного применения
Таблица 1. Критерии эффективности методики идентификации ГМО
| N | Характеристика | Описание характеристики | Критерий | Методы оценки критерия |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Специфичность ПЦР | Способность ПЦР тест-системы выявлять только целевую нуклеиновую кислоту (далее - НК). | ПЦР тест-система должна выявлять целевую НК. ПЦР тест-система не должна давать ложноположительных результатов, в том числе выявлять НК близкородственных и неродственных биологических видов в 100% проводимых исследований. | Для оценки специфичности используют контрольные панели образцов. В состав панели входят образцы, содержащие целевую НК и не содержащие целевую НК (Например, образцы других биологических видов, в том числе близкородственных). |
| 2 | Чувствительность ПЦР | Наименьшее содержание копий целевой НК, которое может быть определено с использованием данной ПЦР методики, в первую очередь зависит от свойств используемых праймеров и зондов. | Чувствительность должна быть не ниже 100 копий целевой НК, например, плазмидной, в одной ПЦР реакции. | Проводят исследования ряда десятикратных разведений целевой плазмидной НК с известной концентрацией в двух повторах каждое. Определяют максимальное разведение, при котором НК воспроизводимо (в двух повторах) выявляется. |
| 3 | Эффективность ПЦР | Характеризует прирост матрицы на каждом цикле амплификации. | Эффективность ПЦР должна быть не ниже 90%. Это соответствуют значению наклона линейной области зависимости Сt от логарифма концентрации ДНК матрицы (slope): не ниже - 3,6 (приемлем диапазон slope 3,1 - 3,6). | Для оценки эффективности ПЦР проводят аплификацию с рядом десятикратных разведений целевой плазмидной НК (см. п.2) в двух повторах каждое. По результатам амплификации строят график зависимости Сt от логарифма концентрации НК матрицы. Определяют наклон линейной области (slope). Эффективность ПЦР оценивают по уравнению: Е = [10(-1/slope)]-1 В идеальном случае - при удвоении количества ПЦР продукта за один цикл: E = 100%, (slope = -3, 32). |
| 4 | Предел обнаружения ПЦР-тест системы, (LOD) | Отражает минимальное количество биологического искомого объекта в исследуемом образце, которое может достоверно обнаружить данный метод. | Чем меньше искомого биологического объекта способен выявить метод, тем выше его чувствительность. Определяется экспериментально, но должен составлять не более 0,1%. | Готовят ряд модельных образцов с разным содержанием целевой матрицы. Готовят образцы целевого ГМ ингредиента (от 5% до 0,001 % содержания) в соответствующей матрице. Исследуют приготовленную панель с использованием ПЦР методики. Определяют минимальное содержание ГМО ингредиента в тотальной НК организма, при котором ГМО воспроизводимо выявляется (в десяти повторах). |
| 5 | Предел количественного определения (LOQ, quantitation limit) | Наименьшее количество (концентрация) вещества в образце, которое может быть количественно оценено с использованием методики с требуемой правильностью и внутри лабораторной прецизионностью. | Для ГМО методик предел должен быть не более 0,1%. На пределе чувствительности относительное стандартное отклонение (RSD) для методик ГМО не должно превышать 20%. Истинное значение измеряемой величины должно входить в полученный при измерениях доверительный интервал. | Исследуют 10 повторов 0,1% ГМО стандарта по ПЦР методике. Рассчитывают среднее значение содержания ГМО в образце и относительное стандартное отклонение (RSD). Сравнивают рассчитанное стандартное отклонение (RSD) с критерием 20% Также оценивают, входит ли истинное значение в доверительный интервал полученного среднего значения. |
| 6 | Аналитическая область (dynamic range) | Интервал определяемых аналитических характеристик, в котором получаемые результаты имеют приемлемый уровень правильности и прецизионности. Для ГМО методик обычно приемлем диапазон 0,1% - 5%. | Диапазон 0,1% - 5% ГМО экспериментальных данных, должен удовлетворять линейной модели (см. п. 7). | Проводят исследования образцов с различным содержанием ГМО Оценивают линейность зависимости аналитического сигнала. |
| 7 | Линейность | Наличие линейной зависимости аналитического сигнала в анализируемой пробе в пределах аналитической области методики. Оценивается как R2 коэффициент корреляции, определяющий верность модели линейной зависимости Сt от логарифма концентрации калибровочных образцов. | R2 коэффициент для калибровочных образцов должен быть не менее 0, 98 %. | Исследуют в двух повторах 0,1%, 1,0 % и 5% калибровочные ГМО стандарты по ПЦР методике. Строят калибровочную прямую (dCt от lgC), оценивают коэффициент корреляции данных с линейной зависимостью (R2). |
| 8 | Правильность | Правильность методики характеризуется отклонением среднего результата определений, выполненных с ее использованием, от значения, принимаемого за истинное. | Методика дает корректные результаты, если значения, принимаемые за истинные, лежат внутри доверительных интервалов соответствующих средних результатов анализов, полученных экспериментально по данной методике. | Готовят образцы из калибровочных стандартов 0,1%, 1,0 % и 5% с добавлением матриц различного происхождения (для этого смешивают стандарты с другими ингредиентами, сухим молоком, мясным фаршем, рыбной мукой). Исследуют образцы по ПЦР методике в двух повторах. Оценивают, входит ли истинное значение в диапазон погрешности полученного среднего значения для каждого образца. |
При использовании методики, основанной на ПЦР, исследование включает последовательные процессы: подготовку проб, выделение нуклеиновых кислот из образцов, амплификацию заданных фрагментов нуклеиновых кислот, детекцию продуктов амплификации, анализ и интерпретацию результатов.
Таблица N 2. Часто используемые маркерные и селективные гены, являющиеся составляющими частями генно-инженерных конструкций
| Мишень | Описание |
|---|---|
| Ген LacZ | Кодирует фермент b-галактозидазу. Используется в векторных плазмидных конструкциях (pCR2.1TOPO, pVIK112, рBSKSII и других), включает область полилинкера для клонирования рекомбинантных генов. При наличии данного фермента бесцветный субстрат X-gal превращается в окрашенный продукт, бактериальные колонии, экспрессиирующие LacZ, имеют голубой цвет. |
| Ген gfp | Ген зелёного флуоресцентного белка используется в ряде векторных плазмид для генно-инженерных манипуляций (pKEN-gfpmut2, pRK415-gfp) в качестве светящейся метки. |
| Ген amp | Кодирует устойчивость к ампициллину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pBR322, рUC18, pBSKSII, рЕТ, pCR2.1 TOPO). |
| Ген Km | Кодирует устойчивость к канамицину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pVIK112, pMC212). |
| Ген tetO | Кодирует устойчивость к тетрациклину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pBR322). |
| F1 ori | Ориджин репликации плазмид (pBSKSII, pKEN-gfpmut2, pCR2.1 TOPO). |
| Транспозон Tn7L | Фрагмент обеспечивает транспозицию рекомбинантных генов из плазмид в геном (pRK415-gfp). |
| Ген ermC | Кодирует устойчивость к эритромицину, плазмидные вектора. |
| Ген сat | Кодирует устойчивость к хлорамфениколу, плазмидные вектора. |
| R6K ori | Ориджин репликации плазмид (pVIK112). |
Обзор документа
Доработан проект Методики проведения молекулярно-генетического исследования ГМО, используемых для производства лекарственных средств для ветеринарного применения.
Проект содержит виды исследований, перечень предоставляемых документов (сведений).
Предложены критерии эффективности методики идентификации ГМО.
